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        禽流感病毒的分類及致病性

        放大字體  縮小字體 樂農網  發布日期:2012-07-04  瀏覽次數:47601
        樂農網禽流感是由A型流感病毒引起雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉等家禽的傳染病,同時也是一種人畜共患病、我國將其列為一類動物傳染病[1]。早
        禽流感是由A型流感病毒引起雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉等家禽的傳染病,同時也是一種人畜共患病、我國將其列為一類動物傳染病[1]。早在1878年,該病就在意大利的流行,當時叫“雞瘟”。1981年在美國馬里蘭州召開的第一屆國際禽流感學術討論會上廢除了“雞瘟”這一病名,改稱高致病性禽流行性感冒。由基于該病在經濟上的重要性,尤其是考慮到該病感染人的巨大威脅,對該病毒的基礎研究顯得迫在眉睫。目前,與其他病毒性疾病相同,禽流感的防制尚無特別有效的方法,接種疫苗是預防禽流感發生與傳播的最有效手段。隨著禽流感病毒多種亞型的發現,以及基礎免疫學理論、分子生物學及生物技術的發展,科研人員已研發出了針對禽流感的數種疫苗。除了應用較為普遍的全病毒滅活疫苗外,對多種新型疫苗的研發也有了較大的進展。本文對目前國內外幾種主要禽流感疫苗進行簡要綜述。
         
        病原
        禽流感病毒(AIV)屬于正黏病毒科, 流感病毒屬。一般多形性,直徑為80-120納米,也可見有同樣直徑的絲狀形態,長短不一。禽流感病毒是分節段的單股負鏈RNA病毒,共有8個獨立的RNA片段,每個RNA片段都以不同的核酸蛋白復合體形式存在。這8個片段編碼10種蛋白,其中有8種結構蛋白, 2種非結構蛋白。病毒表面有10-12納米的密集釘狀物或纖突覆蓋,病毒囊膜內有螺旋形核衣殼。兩種不同形狀的表面釘狀物是HA(棒狀三聚體)和NA(蘑菇形四聚體)。禽流感病毒粒子大約由0.8%-1.1%的RNA,70%-75%的蛋白質,20%-24%的脂質和5%-8%的碳水化合物組成。病毒蛋白包括HA蛋白、NA蛋白NP蛋白、非結構蛋白、M蛋白、聚合酶蛋白。
        禽流感病毒的分類及致病性
        2.1 禽流感病毒的分類
        禽流感病毒(AIV)可按病毒粒子表面的血凝素和神經氨酸酶的糖蛋白進行分類,分為15個H亞型和9個N亞型,其血清型有H1N1、H4N2、H5N1、H5N2、H7N2、H9N2 等。其中最受關注的是含H5和H7血凝素的AIV。這些病毒常表現出具有或轉變為高致病性的潛力(短期內變異),出現這種變異的原因是最初的病毒未受到強有力的控制而得以在許多雞群中繁殖和傳播。有時很難將實驗室分類的結果與病毒可能在某一雞群中引起的病情關聯起來, 即無致病性AIV在有些情況下也可能表現明顯的致病性。
        2.2 禽流感的致病性
        禽流感病毒可分為高致病性、低致病性和非致病性三大類。其中高致病性禽流感是由H5和H7亞毒株(以H5N1和H7N7為代表)引起的疾病。高致病性禽流感特點潛伏期短,傳播快,發病急,發病率高,死亡率高,但傳播范圍往往不大。低致病性禽流感特點是潛伏期長,傳播慢,病程長,發病率和死亡率低,一旦發病,如不采取積極措施,病毒很難在疫區根除,疫情會逐漸向周邊地區擴散,使疫區越來越大,而且病毒毒力還有變強的可能,應高度重視。
        2.3 禽流感的人致病性
        1997年香港首次發現禽流感病毒能感染人并致人死亡的事件之前,研究者雖然提出了禽流感流行的動物源性學說,即病毒在動物內形成重組后再感染人。一般認為,決定流感病毒宿主特異性的主要因素是細胞膜上的受體和HA受體的結合位點的結構。人類與禽類細胞膜上的結合位點有很大的不同,這就是為什么1株流感病毒不能同時感染人和禽的原因。常見的流感病毒受體可因其對人和禽的結合不同分為兩種。但從香港分離到的 HA 受體具有兩種受體結合特異性,因此易于感染人類細胞。最新的研究已經表明,人和禽的流感病毒均可感染豬。而且,禽流感病毒經過豬體中的基因重組或重排過程,可以產生能感染人的新型流感病毒毒株。
        3 AIV理化性質
        AIV對熱敏感,加熱到58℃30min,或加熱到61℃10min,或煮沸(100℃)2min以上即可滅活,但病毒對低溫抵抗力較強,在有甘油保護的情況下可保持活力1年以上;AIV在微生物環境中可存活1周,在水中可存活1個月,在pH=4.1時,也具有一定的存活能力。對紫外線敏感,在陽光下40-48h就會使AIV喪失活性,如果用紫外線直接照射,可迅速破壞其傳染性。對消毒劑乙醚、氯仿、丙酮等有機溶劑敏感。常用消毒劑容易將其滅活,如氧化劑、稀酸、十二烷基硫酸鈉、鹵素化合物( 如漂白粉、碘劑等)都能迅速破壞其傳染能力。
        禽流感的疫苗防控研究
        4.1 防控研究
        流感的防控主要從疫苗防疫、藥物預防、飼養管理等方面綜合進行防治。流感病毒水平傳播效率極高, 其致病力變異極為復雜, 并且對其機制迄今知之甚少, 故禽流感的弱毒疫苗自然成為可望而不可及的奢望。傳統的滅活疫苗具有良好的免疫保護性, 是禽流感防制的主動措施、關鍵環節和最后防線, 在許多國家禽流感防制中都起到了極其重要的作用。禽流感滅活苗的使用, 在控制疫情的同時, 也一定程度上增加了疫病監測中區分疫苗免疫與自然感染的難度,全面的綜合防疫措施與基因工程疫苗相結合才是我國禽流感防制的發展方向。
        4.2 國外現狀
        雖然國外在DNA疫苗、表達AIV血凝素蛋白的新城疫載體疫苗等新型禽流感疫苗研究方面取得了新進展,但是目前國外只有兩種疫苗通過了審批并應用于防控實際,即全病毒油佐劑滅活疫苗和重組雞痘載體禽流感疫苗。重組雞痘載體禽流感疫苗在美國通過了審批,在歐盟沒有類似的產品,但這種疫苗在美國沒有使用,卻廣泛在墨西哥、危地馬拉、薩爾瓦多等國家使用。從全球范圍來看,大多數禽流感免疫預防是用禽流感油佐劑滅活疫苗。
        4.3 我國現狀
        我國科研機構針對現行主要流行毒株亞型,研制了多種油乳劑滅活疫苗1和新型疫苗,取得了良好的免疫保護效果,受到聯合國糧農組織、世界動物衛生組織等國際組織的關注。目前,農業部批準生產的H5亞型禽流感疫苗就有重組禽流感滅活疫苗(H5N1亞型,Re-1株)、禽流感重組雞痘病毒載體活疫苗(H5亞型)、禽流感滅活疫苗(H5亞型,N28株)、禽流感H5-H9二價滅活疫苗、禽流感-新城疫重組二聯活疫苗(rL-H5株)等5種。盡管新型疫苗展現了誘人的前景,但是與國外情形類似,目前我國仍主要使用滅活疫苗。
        疫苗的應用及種類
            由于了解流感病毒的持續遺傳變異是解決流感問題的關鍵,所以不斷地評價病毒的抗原轉變對于及時捕捉到可引起人類流感大流行的毒株,并且研制有效疫苗是非常重要的。理想化的疫苗應具備以下特點:
        1)價格低廉、容易接種,對家禽具有高度的安全性;
        2)任何家禽接種都有效,免疫后既能產生體液免疫應答,又能產生細胞免疫應答,并能迅速建立免疫性保護;
        3)疫苗生產時對工作人員和環境安全;
        4)休藥期短或無休藥期;
            但目前,還沒有任何一種禽流感疫苗同時具備上述全部特性2。因此,逐步完善疫苗的研究顯得尤為重要,現階段常見的禽流感疫苗有以下幾類:
        5.1 全病毒滅活疫苗
            禽流感全病毒滅活疫苗是將疫苗株病毒接種于雞胚尿囊腔中進行增殖,經梯度離心濃縮純化后,用甲醛或者β-丙內酯滅活處理制得。Takada 等對5周齡雌性ddY小鼠鼻腔接種用甲醛滅活的流感全病毒疫苗20μL,2~3 周后再免,最后1次免疫后1周,分別檢測血清和鼻拭子樣品,并同時經鼻腔攻擊20倍小鼠半數致死量的病毒,結果表明,該疫苗既可產生中和抗體,又能刺激機體CTL 反應,并能抵御不同亞型流感病毒的攻擊。李明義等3-4用禽流感病毒A/Ostrich/Denmark/77420/96(LPAI- H5N2)株及A/Chicken/ Shanghai/1/98(H9N2)株分別接種易感雞胚,收獲感染胚液并超濾濃縮,再用甲醛滅活并加油佐劑混合乳化制成油乳劑滅活疫苗,將其接種4周齡SPF雞,結果表明,疫苗安全。
        禽流感全病毒滅活疫苗具有制備工藝簡單、免疫效果及安全性好、免疫持續時間長且不會出現毒力返強和變異的優點,可保護同種亞型AIV的攻擊,有效避免禽流感的大暴發或大流行。但滅活苗本身存在一些缺陷,即影響疫情監測,存在散播病毒的風險,免疫劑量較大,制備成本高等。其最突出的缺點是不能誘導產生有效的黏膜免疫抗體和細胞免疫應答,因而,無法有效地抑制呼吸道中 AIV的復制5。
        5.2 亞單位疫苗
        亞單位疫苗是提取AIV具有免疫原性的抗原蛋白,加入佐劑而制成的。這種疫苗安全性好,能刺激機體產生足夠的免疫力,但其抗體持續時間短,且成本高。隨著重組 DNA及分子克隆技術的發展,可以將HA基因連接到載體質粒上,然后導入表達系統中,經誘導可獲得大量表達的免疫原性蛋白,提取所表達的特定多肽,加入佐劑即可制成基因工程亞單位疫苗,這樣可大大降低成本。劉明6構建了桿狀病毒轉移載體,分別表達了H5N1亞型禽流感病毒的HA基因和 NA 基因,用這些表達產物免疫SPF雞,結果顯示,NA+HA 聯合免疫組的免疫效果最佳。Wu 等7用酵母表達禽流感A/Northern shorel-er/AL/26/2006(H10N7)株的HA蛋白,然后用該蛋白免疫SPF雞,可以產生與滅活苗相同效果的HI抗體及中和抗體。
        5.3 重組活載體疫苗
            利用對禽類致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作載體,構建含有免疫原性基因的重組病毒,用此重組病毒作疫苗,可在動物體內復制,并不斷地表達出免疫原性蛋白,從而誘導禽類產生針對目標病原的免疫保護力,此種疫苗稱為重組活載體疫苗。Boyle等8構建了表達H7亞型HA基因的重組痘病毒,接種2-7日齡雞,分別于接種后第10,21天,用強毒株攻擊,致死保護率分別為80%和100%。獲得保護雞有NP抗體反應,表明重組痘病毒疫苗雖可提供堅強保護,但不能完全阻止攻毒AIV的復制。Swayne 等9研究表明,禽流感重組痘病毒疫苗應避免用于經痘病毒疫苗免疫的雞群或自然感染野毒痘病毒雞群,否則,將不能誘導其對禽流感的良好免疫應答。Li等10將高致病性的 H7N1 血凝素基因插入到 HVT,構建了重組病毒,免疫動物產生特異性抗HVT和AIV HA 抗體,對HVT 和AIV強毒的攻擊均能提供良好的保護。Qiao等11構建了能同時表達H5N1亞型HA基因和NA基因的重組禽痘病毒(fowl pox virus,FPV)重組疫苗,攻毒結果顯示,該疫苗具有良好的免疫保護性。高宏博等12AIV A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)的HA基因克隆于真核表達質粒中,構建了轉移載體pUAB- gpt- HA,通過同源重組及霉酚酸篩選技術,將HA基因表達盒插入到HVT US10 基因區,構建了一株表達H5亞型AIV HA 基因的重組病毒 HVT(rHVT- US10- HA),經PCR、間接免疫熒光、western blot 及紅細胞凝集試驗鑒定,重組病毒能穩定表達具有生物學活性的HA蛋白。
        重組活載體疫苗兼具死疫苗和活疫苗的優點,克服了常規活疫苗毒力返強的缺點,且免疫效果較理想。但重組載體系統本身特性以及在對插入的外源基因的選擇等方面仍存在很多問題,仍需進一步研究。
        5.4 核酸疫苗
            核酸疫苗又稱為DNA疫苗,是伴隨現代分子生物學和免疫學的發展而產生的一種新型疫苗。其原理是利用重組DNA技術將保護性抗原蛋白的基因克隆到真核表達載體上,在被直接導入到動物體內后,保護性抗原蛋白基因表達的抗原蛋白經過內源性呈遞給免疫系統,誘導機體產生特異性的體液免疫和細胞免疫反應。何宏軒等13-14將不同亞型AIV的HA基因構建了真核表達質粒,并用構建好的質粒對試驗雞進行免疫,進行攻毒后,將免疫組和對照組的試驗結果進行比較,結果表明,所構建的HA基因表達質?勺鳛榛蛞呙缯T導雞產生免疫保護反應。張丹等15設計并構建了包含禽流感H5HA和H7HA1基因的雙價真核表達質粒pV- H5- H7及單獨表達 H5HA和H7HA1的 pV- H5 和 pV- H7HA1,通過RT- PCR,間接免疫熒光(IFA)等方法驗證構建質粒的正確性和其表達蛋白的免疫原性;0,21 d 分別免疫6~8周齡的BALB/c 小鼠,設立雙價疫苗組、單表達免疫組和對照組;免疫后35 d 用HPAIVH5N1進行致死性攻擊,結果顯示,免疫組均可刺激機體產生H5特異性抗體,pV- H5- H7 誘導產生的抗體對H5N1的攻毒保護率為80% ,而pV- H5 單表達的攻毒保護率也為80%。
        核酸疫苗有許多優點,能長時間表達抗原;具有與天然抗原相同的構象和免疫原性,可同時激發機體產生細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫應答,而且不受母源抗體的干擾;結構簡單,制備方便;穩定性好,易于保存和運輸;能夠克服由于免疫系統發育不完善而導致的免疫力低下的缺陷;可用于制備多價疫苗或聯苗。
        目前,核酸疫苗還存在許多安全方面的問題:質粒DNA低水平整合到宿主基因組的潛在危險性;核酸疫苗載體攜帶的抗生素基因可能導致的生物學后果;產生針對雙鏈DNA的抗體;引起免疫耐受。針對這4種潛在的危害性,美國 FDA,WHO及EU都對核酸疫苗的研制制定了一些指導性規定,為核酸疫苗的研究、生產及應用指明了方向。由于核酸疫苗成本相對較高,且不適于集約化養殖群體的免疫,因此,可考慮改進核酸疫苗生產工藝和優化疫苗接種方式來開發出價格低廉、實用化的核酸疫苗。
        5.5 新型疫苗
        近年來,新的分子生物學技術(如反基因操縱子技術)的應用為禽流感多價疫苗的研發提供了新的方法和途徑,并由此產生了反基因工程疫苗。病毒的反向遺傳技術(rever se genetics ,RG)或稱病毒拯救,是指根據病毒基因組及其復制
        的特點建立操作系統,利用克隆的cDNA產生病毒的過程。由于可以產生經過人工操作基因后的病毒,因此在病毒的疫苗構建方面具有良好的應用前景。
            為了對抗不斷改變的禽流感病毒抗原型,能夠提供交叉保護性的通用疫苗逐漸成為研究者關注的熱點。一些研究者還利用分子生物學手段篩選流感病毒的抗原表位,并運用計算機模擬技術對其進行優化,進而研制出抗原表位疫苗,為易變異的病毒疫苗的研制提供了新的思路16。此外,利用植物作為生物反應器,大量表達外源蛋白的轉基因植物可食疫苗,也受到了廣泛的關注,F今新型的禽流感疫苗包括冷適應流感弱毒疫苗、基因工程流感病毒活疫苗、復制缺陷型流感病毒疫苗、RNA復制子疫苗、表位疫苗、轉基因植物疫苗、沙門氏菌DNA口服疫苗等。
            20124月10日, 國際知名病毒學雜志Journal of Virology在線發表了中科院上海巴斯德研究所周保羅研究組關于高致病性禽流感H5N1疫苗的最新成果,這是世界上首次報道能誘導出針對所有高致病性禽流感H5N1亞類和亞亞類廣譜中和抗體反應的免疫原。但目前,還沒有任何一種禽流感疫苗同時具備上述全部特性。
           在本項研究中,博士研究生周梵、研究助理王桂芹等在周保羅研究員的指導下,在全面的血清學研究基礎上開發設計了能夠有效地對抗所有高致病性禽流感H5N1亞類和亞亞類的免疫原的新策略。首先,她們構建了涵蓋所有高致病性禽流感H5N1亞類和亞亞類代表性流行株的H5HA表達質粒庫;利用該質粒庫,建立了相應的假病毒庫和免疫血清庫;然后進行了全面的基于假病毒的血清學試驗。研究人員按照試驗結果,將高致病性禽流感H5N1亞類和亞亞類歸納成兩大抗原群,但亞亞類2.3.2.1和7.2分別獨立于這兩個抗原群之外。根據上述所得抗原群,她們設計了三價疫苗,并證明其能誘導出針對所有高致病性禽流感H5N1亞類和亞亞類的廣譜中和抗體反應(見圖1),并對小鼠在高致死量的異源H5N1病毒攻毒下提供有效的保護。
        1 三價疫苗誘導出了針對所有高致病性禽流感H5N1亞類和亞亞類的假病毒庫的廣譜中和抗體反應
        6 禽流感疫苗的發展方向
        目前而言,研制出高效、安全、生產工藝簡單、價格低廉、實用的禽流感疫苗有重要意義,對禽流感的防制越來越重要。滅活疫苗和活疫苗由于自身的缺陷,只能用于禽流感暴發時的應急免疫,以減少經濟損失,而不宜作常規免疫。以哺乳動物細胞為基質制備流感疫苗,研究不深入,工藝復雜,成本較高,目前不是禽流感理想疫苗的選擇。對于DNA核酸疫苗來說,免疫原單一,能長時間表達抗原,可避免母源抗體的干擾,易于構建和制備,易凍干,成本低,穩定性好,貯存和運輸相對方便,成本較低廉。雖然核酸疫苗具有很多優點,但DNA疫苗本身仍存在安全性問題:①轉入體內的外源DNA可能整合到宿主染色體基因組DNA上,使宿主細胞轉化為癌細胞;②少量抗原長期表達很可能引起針對該抗原的免疫耐受,在遭遇病原體后反而會引起嚴重感染。因此,盡快解決這些問題,使基因工程疫苗得到廣泛的應用將是今后禽流感疫苗研究的重點。
        結語
            任何禽流感控制計劃的最終目的是根除禽流感。采取以免疫接種和撲殺相結合的防控技術對策是我國的一大特色。其中,全面免疫是防控禽流感的關鍵技術措施和突出特點,具有至關重要的作用,在以后相當一段時間內仍需要堅持。隨著我國養禽業的迅猛發展,對禽流感的防制越來越重要。因此,研制出安全、高效、生產工藝簡單、價格低廉、適用的禽流感疫苗意義重大大,但是,禽流感病毒血清型眾多、容易變異的特點給禽流感疫苗的研制帶來了很大困難。隨著科技的進步和人們對生命認識的不斷加深,相信能夠改變禽流感病毒防制狀況的新型疫苗的出現指日可待。
         
         
         
         
         
         
         
         
         
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